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76° Corso CEFAR (Centro Europeo per la Formazione. l’Aggiornamento e la Ricerca in Scienze Sanitarie e Biotecnologiche)

Milano 14-15 Maggio 1997 : “La citometria a flusso nella diagnostica di laboratorio”

Valutazione della cromatina nucleare e della funzionalità’ mitocondriale degli spermatozoi

Edoardo Colombo - Carlo Colzani : Laboratorio di Citometria a Flusso - Ospedale Valduce - Como

L’uso della citometria a flusso in campo seminologico ha permesso di rendere ripetibili , oggettivi ed affidabili alcuni tests che gia’ da qualche anno venivano eseguiti con lettura al microscopio a fluorescenza : essa aggiunge inoltre ulteriori parametri di valutazione e riduce drasticamente tempo e denaro necessari per l’esecuzione dei tests stessi .

Vengono di seguito illustrati due tests oggi disponibili in citometria a flusso : la valutazione della cromatina nucleare e della funzionalità’ mitocondriale degli spermatozoi

Il Test all’ Arancio di Acridina nella valutazione della cromatina nucleare degli spermatozoi (SCSA)

L’ arancio di acridina (AO) e’ un fluorocromo della famiglia delle Acridine, specifico per gli acidi nucleici (DNA/RNA) definito metacromatico , ossia con due diversi spettri di emissione : l’AO a bassa concentrazione e con rapporto colorante/proteine basso si lega al DNA doppia elica ed emette fluorescenza verde attorno ai 525 nm ; all’aumento del rapporto colorante/proteine , l’AO provoca condensazione dell’acido nucleico a singola elica (RNA o DNA singola elica) ed emette fluorescenza rossa attorno ai 575 nm . Questa differente sensibilità’ degli acidi nucleici alla condensazione indotta dall’ AO e’ la base della differente colorazione del DNA versus RNA.

Questa proprietà’ si e’ rivelata particolarmente utile negli anni scorsi per lo studio in simultanea del contenuto cellulare di RNA e DNA e per la loro quantizzazione. Nel campo della fertilita’ , i maggior progressi si sono avuti alla meta’ degli anni 80 con i lavori di Darzynckievicz ed Evenson (J Histochem Cytochem 30,1982 - Science 210,1980) che hanno dimostrato come la cromatina degli spermatozoi di mammiferi possa presentare diversi gradi di denaturazione tali da rendere lo spermatozoo non idoneo alla fecondazione .

Ai primi lavori eseguiti su animali , Evenson ha fatto seguire poi esperimenti su sperma umano che hanno confermato i dati osservati precedentemente (J Histochem Cytochem 31,1983) .

Il test all’arancio di acridina , oggi conosciuto come Two Steps Stain with Acridine Orange (TSSAO) o Sperm Chromatine Structure Assay (SCSA) , si basa sul principio che il DNA delle cellule possiede una differente suscettibilità alla parziale denaturazione indotta dal calore o dall’acido ; nel caso specifico valuta la percentuale di spermatozoi con DNA denaturato (singola elica) rispetto a quelli con DNA normale (doppia elica) previo contatto con una soluzione acida (HCl 0.08 M) . Il test e’ in grado di identificare con certezza campioni subfertili o sperma di bassa qualità’ (J Histochem Cytochem 31,1983) .

La lettura al microscopio a fluorescenza e’ difficile e molto poco standardizzabile , poiche’ lo spettro delle emissioni dell’AO tende ad accavallarsi ; il citometro a flusso viceversa può’ mantenere una lettura oggettiva grazie all’uso dei filtri ottici ed alla conversione della fluorescenza ottenuta in dati digitali . Inoltre e’ ormai entrato nell’uso corrente il parametro denominato Alfa t che esprime la percentuale di DNA denaturato presente all’interno della popolazione testata. Esso e’ il rapporto tra la fluorescenza rossa media fratto la fluorescenza rossa media + la fluorescenza verde media ovvero :

Alfa t = Red / (Red + Green)

Un DNA perfettamente conservato presenta un Alfa t = 0 . Maggiore il degrado , minore la fertilità’ dello spermatozoo .

La lettura al citometro a flusso con istogrammi biparametrici riportanti le due fluorescenze verde e rossa sugli assi , consente di ben evidenziare la quantita’ di DNA denaturato presente all’interno del campione in un tempo breve , con oggettivita’ e minimo dispendio economico.

Pertanto il TSSAO risulta essere un test di elevato interesse per chi si occupa di fertilita’ ,sia essa umana o veterinaria , sia in vivo che in vitro.

Il Test alla Rhodamine 123 nello studio dei mitocondri degli spermatozoi

La Rhodamine 123 e’ un colorante cationico specifico per i mitocondri a causa della elevata elettronegativita’ di questi organelli ; eccitabile a 488 nm con emissione attorno ai 525 nm , essa penetra velocemente la membrana cellulare e viene rapidamente captata (pochi minuti) senza alcun effetto citotossico; nessun altro componente cellulare assume il colorante . Il legame del fluorocromo con il mitocondrio non e’ irreversibile e il semplice lavaggio delle cellule consente di allontanare il colorante dalle stesse : cio’ ha grande valenza nel caso di sorting per purificazione e successivo impiego delle cellule.

La Rhodamine 123 e’ attualmente impiegata , oltre che nello studio dei mitocondri degli spermatozoi (J Histochem Cytochem 41,1993) , nello studio delle cellule con deficit respiratori (J Cell Biol 111,1990) , nella valutazione della multidrug resistance (Mol Pharmacol 45,1994) , nello studio della suscettibilita’ alla terapia per il micobatterio (Biochemistry 33,1994) , nella valutazione dell’attivita’ enzimatiche mitocondriali (J Cell Biol 112,1991) , nello studio del potenziale di membrana mitocondriale (Cytometry 15,1994) , nell’apopotosi (J Cell Biol 123,1993) e nello studio della vitalita’ batterica (J Appl Bacteriol 72,1992) .

L’attivita’ mitocondriale e’ stata associata alla motilita’ degli spermatozoi gia’ dalla meta’ degli anni 70 e nel 1980 questa correlazione ricevette accreditamento scientifico (Proc Natl Acad Sci USA 1980) .I dati ottenuti da quattro anni di analisi eseguite presso il nostro Laboratorio indicano una corrispondenza tra motilita’ morfologica al microscopio ottico e valore ottenuto al citometro .

L’applicazione della metodica per lo studio dei mitocondri degli spermatozoi in citometria a flusso consegue due importanti fini : standardizzazione della lettura , punto dolente di ogni metodica in immunofluorescenza su vetrino ; semplicita’d’uso e basso costo .L’analisi citometrica consente di valutare in modo oggettivo la quantita’ di mitocondri funzionali della popolazione spermatozoica esaminata , testando un grande numero di cellule (solitamente 25.000) , indipendentemente dall’operatore e dalla sua esperienza specifica ; la quantita’ di fluorescenza letta dallo strumento ha consentito negli scorsi anni al nostro Laboratorio di Citometria di stilare tre classi di valutazione , basate sull’analisi di 1014 campioni patologici provenienti dal Centro per la Cura della Sterilita’ del nostro Ospedale e di 200 campioni normali : Normale (UA > 200) ; Ridotta (UA tra 100 e 200) ; Bassa (UA <100) .

Tali classi riportano in Unita’ Arbitrarie (U.A.) il rapporto tra la autofluorescenza della popolazione spermatozoica (considerata come negativo) e il canale massimo di fluorescenza raggiunto : piu’ precisamente la formula impiegata si puo’ riassumere come U.A. = (fluorescenza massima - negativo ) / negativo . Notate che l’uso di un rapporto ,anziche’ di un valore di fluorescenza ,consente di ottenere risultati comparabili sessione per sessione .

Per arrivare al dato finito ,inoltre, si deve impiegare un citometro che mediante il parametro tempo (Time) consenta di leggere in cinetica la fluorescenza ottenuta , monitorare la sua SD ed ottenere la Mean della popolazione priva di colorante e la Mean della fluorescenza dopo colorazione; qualora il parametro tempo non sia disponibile (per mancanza sul citometro o per dati acquisiti senza tale parametro) e’ possibile ricompilare il file listmode inserendo il parametro tempo mediante l’uso di software dedicato e interazione con un supporto informatico compatibile con scambio dinamico dei dati (DDE) come Excel .