INTRODUZIONE
In questa tesi vengono studiate le proprietà fotofisiche di nuovi complessi degli ioni Eu3+ e Tb3+ con leganti a gabbia contenenti gruppi cromofori. Tali leganti hanno la caratteristica di avere una cavità tridimensionale, preesistente alla complessazione o formatasi in seguito ad essa, complementare alle dimensioni dello ione [1,2,3].
L'aspetto principale che interessa questo studio consiste nel fatto che in complessi di questo tipo è possibile ottenere una luminescenza dello ione metallico incluso per assorbimento di luce da parte del legante, seguito da trasferimento di energia da stati emittenti del legante a stati eccitati del metallo, (effetto antenna) [4,5]. L'intensità della luminescenza e il tempo di vita dello stato eccitato che emette tale luminescenza possono essere ottimizzati attraverso lo schermaggio che il legante può effettuare nei confronti dello ione incluso, utilizzando leganti i cui stati eccitati abbiano valori di energia opportuni e che interagiscano efficacemente con lo ione centrale.
La luminescenza in soluzione di complessi di Eu3+ e Tb3+ è risultata negli ultimi anni di notevole interesse per svariate applicazioni in campo biologico [6,7]. Di particolare importanza è l'uso di tali complessi come traccianti luminescenti in analisi immunologiche.
Lo studio fotofisico dei composti studiati in questa tesi oltre, agli aspetti di base, è dunque finalizzato alla possibilità di usare i complessi studiati come traccianti fotoluminescenti in immunologia.
Bibliografia
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[2] J.M. Lehn, Angew. Chem. Int. Ed Engl., 27 (1988) 89.
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[7] I.A.Hemillä, Application of Fluorescence in Immunoassays, Wiley, New York 1991.
CAPITOLO I: Gli ioni lantanidi trivalenti
1.1) Fotofisica dei lantanidi
L'hamiltoniano che descrive uno ione lantanide trivalente (Ln3+) isolato è quello di un atomo a molti elettroni (1), con l'orbitale 4f in progressivo riempimento passando dal La3+ al Lu3+.
N N N
(1) H=&Mac183;hi +&Mac183; (e2/rij) +&Mac183;x(r) l®s
i i<j i
hi è l'hamiltoniano monoelettronico dell'elettrone iesimo, il secondo termine è la somma su tutti gli elettroni delle repulsioni inter-elettroniche e il terzo è la somma su tutti gli elettroni degli accoppiamenti spin orbita.
L'equazione di Schrödinger stazionaria, dati i termini perturbativi della repulsione inter-elettronica e dell'accoppiamento spin-orbita, non è risolubile esattamente ma occorre usare metodi approssimati per ricavare le autofunzioni e le loro energie [1]. A livello puramente qualitativo possiamo usare il metodo di accoppiamento di Russel-Saunders che ci permette di etichettare gli stati e le regole di Hund per prevedere se uno stato si trovi ad energie più alte o più basse di un altro [2]. Secondo tale schema di accoppiamento ogni configurazione a causa dell'interazione fra gli elettroni fa sorgere tanti termini spettrali ad energie diverse tante quante sono le coppie (L,S), con L=&Mac183;ili e S=&Mac183;isi. Ogni termine spettrale ha degenerazione pari a (2L+1)*(2S+1). La degenerazione dei termini (L,S) è parzialmente rimossa a causa dell'interazione spin orbita ed ogni termine spettrale si divide in tanti livelli J con J={L+S, L+S-1,....|L-S|}. Ogni livello J ha degenerazione pari a 2J+1.
I termini (L,S) si indicano con lettere maiuscole con S se L=0, P se L=1, D se L=2, F se L=3 etc.; la molteplicità 2S+1 appare come apice a sinistra, mentre i livelli J sono rappresentati con il pedice J a destra.
Le regole di Hund, che possono essere giustificate fisicamente, per i Ln3+ sono le seguenti:
1) Il temine spettrale a più bassa energia è quello con molteplicità più alta.
2) Fra termini con la stessa molteplicità quelli con L maggiore hanno energia più bassa.
3) Fra i livelli J quello più basso in energia è quello con J minore se l'orbitale f è riempito meno di metà, mentre è quello con J maggiore se esso è riempito più di metà.
La figura 1.1 mostra gli stati J per alcuni Ln3+ intraconfigurazionali alla [Xe]4fn.
Lo ione in un ambiente di coordinazione è sottoposto ad una ulteriore perturbazione, detta del campo dei leganti, che nasce dall'interazione fra gli elettroni del guscio f e quelli del legante [3,4].
L'effetto della perturbazione è quello di rimuovere parzialmente o totalmente la degenerazione degli stati J, creando dei sublivelli (sublivelli di Stark) il cui numero dipende dalla simmetria di coordinazione dello ione.
La figura 1.2 mostra gli stati di un generico Ln3+ in un ambiente di coordinazione e le loro separazioni energetiche. I termini spettrali sono separati da alcune decine di migliaia di cm-1, gli stati J da poche migliaia e i sublivelli di Stark da poche centinaia.
Figura 1.1: Rappresentazione degli stati J intraconfigurazionali alla [Xe]4fn per alcuni Ln3+. I livelli contrassegnati dal simbolo t rappresentano gli stati emittenti.
Figura 1.2: Separazione energetica degli stati della configurazione fondamentale [Xe]4fn di un generico La3+ a causa delle repulsioni inter-elettroniche, dell'accoppiamento spin orbita e dell'interazione del campo dei leganti.
La separazione fra i livelli J nei Ln3+ è molto maggiore rispetto a quella fra i sublivelli di Stark, contrariamente a quanto accade ai metalli del blocco d. Ciò è dovuto al fatto che le interazioni fra gli elettroni dei leganti e quelli degli orbitali 4f, schermati dagli elettroni negli orbitali 5s e 5p, sono molto piccole. La tabella 1.1 mostra l'effetto della perturbazione del campo dei leganti sui livelli J dello ione Eu3+ [2].
Simmetria
0Æ0
0Æ1
0Æ2
0 Æ3
0Æ4
0Æ5
0Æ6
Icoesaedrica
1
1
1
2
2
3
4
Cubica1 1 1 2 3 4 4 6
Esagonale2 1 2 3 5 6 7 9
Pentagonale3 1 2 3 4 5 7 8
Tetragonale4 1 2 4 5 7 8 10
Bassa5
1 3 5 7 9 11 13
1 Oh, O, Td, Th, T
2 D6h, D6, C6v, C6h, C6, D3h, C3h, D3d; D3, C3v, S6, C3
3 D5h, C5h, Ccv, C5, D5
4 D2h, D2, C2v, C2h, C2, Cs, S2, C1
Tabella 1.1:Numero di sublivelli di Stark attesi per le transizioni dal 5D0 al multipletto fondamentale dello ione Eu3+ in base alla simmetria dell'intorno di coordinazione.
Nei Ln3+ le bande di assorbimento ed emissione sono molto strette, da un nanometro a qualche decina; quest'ultima caratteristica è dovuta al fatto che gli stati eccitati hanno la stessa geometria di equilibrio dello stato fondamentale.
Le intensità delle transizioni f-f sono state interpretate dalla teoria di Judd-Ofelt [3,4]. Le transizioni di dipolo elettrico sono proibite principalmente dalla regola di Laporte. Secondo la teoria di Judd-Ofelt la regola di Laporte è parzialmente rimossa a causa della perturbazione del campo dei leganti e dei moti vibrazionali. Entrambi i fenomeni contribuiscono a mescolare gli stati dispari della configurazione [Xe]4fn con quelli pari della [Xe]4fn-15d e [Xe]4fn-15g e ciò rende debolmente permesse le transizioni f-f. In modo del tutto analogo l'accoppiamento spin orbita mescola gli stati con molteplicità diversa rendendo parzialmente permesse le transizioni spin proibite. Le transizioni di dipolo magnetico invece non sono proibite dalla regola di Laporte, ma hanno intensità di alcuni ordini di grandezza più piccoli.
Dunque i Ln3+ mostreranno bassi coefficienti di estinzione (meno di 10 M-1cm-1 ) e alti tempi di vita naturali degli stati emittenti (dai microsecondi a qualche millisecondo) [5,6,7]. I tempi di vita misurati in soluzione possono accorciarsi rispetto a quello naturale a causa di fenomeni di disattivazione nonradiativa dello stato emittente.
Un fenomeno che può contribuire a disattivare lo stato emittente è quello attraverso il popolamento di stati eccitati che poi si convertono nonradiativamente allo stato fondamentale. Un altro meccanismo di disattivazione nonradiativa è quello attraverso l'accoppiamento vibronico con oscillatori ad alta energia nella prima sfera di coordinazione ed è tanto più veloce quanto più è bassa la differenza di energia fra lo stato emittente e il livello J ad energia più alta del multipletto fondamentale. Quest'ultima considerazione, osservando la figura 1.1, spiega perché l'intensità di emissione e i tempi di vita diventino più elevati per i cinque Ln3+ centrali, Sm3+, Eu3+, Gd3+, Tb3+ e Dy3+, e in particolare per Eu3+ e Tb3+.
Gli stati emettitori dello ione Eu3+ sono il 5D0, il 5D1, 5D2 e il 5D3; in soluzione le transizioni più intense sono quelle dal 5D0, mentre le transizioni dal 5D1 hanno intensità di due o tre ordini di grandezza più piccoli e quelle dagli altri due stati non sono misurabili [5]. Le transizioni che mostrano una influenza particolare nei confronti dell'ambiente coordinante son dette ipersensitive; tra le transizioni 5DoÆ7Fj dell'Eu3+ l'ipersensitiva è la 0Æ2. La tabella 1.2 ci riassume tutte le caratteristiche selle transizioni dell'Eu3+ [2].
J Carattere Intervalloa Intensitàb Commenti
Transizioni dal 5D0
0 DE 577-581 m-d Transizione non degenere proibita: aumenta di intensita grazie al J mixing nelle simmetrie Cs, Cn e Cnv.
1 DM 585-600 f Permessa: intensità in parte dipendente dall'ambiente: mostra forte attività ottica.
2 DE 610-625 m-f Ipersensitiva: é assente se il metallo é in un centro di inversione.
3 DE 640-655 m-d Proibita e spesso molto debole: il j mixing le aggiunge un carattere DM che ne aumenta l'intensità.
4 DE 680-710 f Sensibile all'ambiente di coordinazione.
5 DE 740-770 n-m Proibita:raramente osservata.
6 DE 810-840 n-m Raramente osservata.
Transizioni dal 5D1
0 DM 524-528 m-d Raramente osservata.
1 DE 530-540 m-d Sensibile all'ambiente.
2 DE 550-565 m-d Molto debole.
a Principale carattere dipolare: DE dipolo elettrico, DM dipolo magnetico
b Intensità carattere dipolare: n-m non misurabile, m-d molto debole, m media, f forte, m-f molto forte
Tabella 1.2: Caratteristiche delle principali transizioni per l'Eu3+.
L'unico stato emittente osservato in soluzione per Tb3+ è il 5D4; la tabella 1.3 ci mostra le caratteristiche delle transizioni che avvengono da questo stato [2].
La figura 1.3 mostra gli spettri di Tb3+ e Eu3+ in soluzione mentre la figura 1.4 le energie dei loro stati. E' interessante notare come il 5D4 del Tb3+ si trovi a circa 3000 cm-1 più in alto rispetto al 5D0 dell'Eu3+ e come la separazione energetica fra lo stato emittente e il livello J a più alta energia sia più grande per l'europio che per il terbio. Queste caratteristiche come vedremo in seguito differenziano notevolmente il comportamento fotofisico dei complessi dei due cationi.
Figura 1.3:Spettri in soluzione di Eu3+ e Tb3+. Nei riquadri piccoli sono riportate amplificati i segnali relativi alle transizioni meno intense.
Figura 1.4: Energie degli stati per Eu3+ e Tb3+.
J
Intervallo
Intensità a
Commenti
6 480-505 f Sensibile all'ambiente di coordinazione.
5 535-555 m-f Mostra forte attività ottica.
4 480-600 f Sensibile all'ambiente di coordinazione: mostra una media attività ottica.
3 615-625 m Mostra forte attività ottica.
2 640-655 d Sensibile all'ambiente di coordinazione.
1 660-670 m-d Sempre debole.
0 675-680 m-d Sempre debole.
a Intensità carattere dipolare: n-m non misurabile, m-d molto debole, d debole, m media, f
forte, m-f molto forte
Tabella 1.3: Caratteristiche delle principali transizioni per Tb3+.
2.2) Bibliografia
[1] C.K. Jørgensen, Struct. Bonding (Berlin), 22 (1975), 49.
[2] J.G.C. Bünzli, in J.G.C. Bünzli, G.R.Choppin, Eds, "Lanthadide Probes In Life, Chemical And Earth Sciences", Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 1989, p. 226.
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[9] W. Strek, J. Chem. Phys., 76 (1982), 5856.
CAPITOLO II: Luminescenza degli ioni Eu3+ e Tb3+ nei loro complessi
2.1) Classi di leganti a gabbia che danno complessi con gli ioni Eu3+ e Tb3+
I leganti della chimica di coordinazione classica con molta difficoltà danno complessi stabili con gli ioni Eu3+ e Tb3+. Tale difficoltà è dovuta alle caratteristiche elettroniche degli ioni trivalenti dei lantanidi, avendo essi gli elettroni negli orbitali 4f schermati dagli orbitali esterni 5s e 5p.
Invece leganti policiclici progettati e sintetizzati più recentemente, ad esempio criptanti, podanti, macrocicli ramificati e calixareni funzionalizzati, formano con gli ioni Ln3+ complessi stabili termodinamicamente e cineticamente inerti, grazie alla formazione di una gabbia attorno allo ione.
La figura 2.1 rappresenta schematicamente i complessi con le classi di leganti sopra riportate.
Figura 2.1: Classi di leganti che danno complessi con gli ioni europio e terbio.
2.2) Effetto antenna
In questi complessi l'assorbimento di luce negli stati eccitati centrati sul legante (LC) può dar luogo alla popolazione degli stati emittenti del metallo in seguito a trasferimento di energia intramolecolare [1, 2, 3, 4, 5].
In questo processo il legante agisce come un' antenna capace di assorbire energia luminosa e trasferirla al metallo (Figura 2.2). L'intensità di luminescenza del metallo in tali complessi dipende principalmente dalle grandezze seguenti:
Figura 2.2: Rappresentazione dell'effetto antenna: i cromofori (blu) assorbono luce nell'UV, danno origine ad un processo di energy transfer al metallo (LMET) rappresentato dalla freccia viola ed infine il metallo emette nel visibile (freccia rossa).
1) efficienza dell'assorbimento del legante (e)
2) efficienza del processo di trasferimento di energia (het)
3) efficienza della luminescenza del metallo nel complesso (hM).
Il coefficiente di estinzione molare è ovviamente misurabile direttamente: l'efficienza del processo di trasferimento di energia e quella di emissione del metallo nel complesso sono invece determinabili indirettamente da misure di rese quantiche di luminescenza per eccitazione rispettivamente del legante (FL) e del metallo (FM) (figura 2.3 ed espressioni ¥ e ¥¥).
¥) het = FL/FM
¥¥) hM = FM
Figura 2.3: I due rendimenti quantici: a sinistra quello ottenuto per eccitazione sul legante e a destra quello ottenuto per eccitazione sul metallo.
Tuttavia, a causa dei bassi coefficienti di estinzione molari dei complessi e dell'alto assorbimento del legante in questa zona spettrale, FM è una grandezza difficilmente misurabile.
L'efficienza della luminescenza del metallo può essere però ricavata in modo approssimato da misure di tempi di vita condotti in diverse condizioni sperimentali (¥¥¥).
¥¥¥) hM =
t è il tempo di vita osservato e t°r è il tempo di vita radiativo: una approssimazione di questo la si ottiene misurando il tempo di vita dopo aver inibito ogni processo di disattivazione nonradiativa.
Supponiamo di condurre le nostre esperienze in un solvente contenente gruppi OH (acqua, metanolo etc.) e nei corrispondenti deuterati. Il tempo di vita dello stato emittente in un solvente non deuterato a temperatura ambiente è dato dall'equazione ¥V:
¥V)
dove knr(OH) è la costante relativa al processo di accoppiamento vibronico con gli oscillatori OH, knr(O.V.) è la costante relativa ai processi di accoppiamento vibronico su altri oscillatori, knr(T) è quella relativa ai processi termicamente attivati e k°r quella relativa al decadimento radiativo.
Se knr(O.V.) è trascurabile, considerando che a 77K è trascurabile ogni processo termicamente attivato e che nei solventi deuterati sia trascurabile l'accoppiamento vibronico, rappresenterà una approssimazione del tempo di vita radiativo dello stato emittente:
V)
L'efficienza della luminescenza del metallo nel complesso sarà dunque:
V¥) hM
e l'efficienza di trasferimento di energia da:
V¥¥) hET
2.3) Processi di disattivazione nonradiativa degli stati emittenti
Le più importanti disattivazioni nonradiative degli stati luminescenti del metallo nei complessi studiati sono:
1) disattivazioni nonradiative attraverso l'accoppiamento vibronico con gli oscillatori di molecole di solvente presenti nella prima sfera di coordinazione
2) disattivazioni nonradiative attraverso stati di trasferimento di carica coinvolgenti il legante e il metallo
3) disattivazioni non radiative attraverso il processo di "back energy transfer" agli stati eccitati di tripletto.
Illustriamo ora il processo uno.
La disattivazione nonradiativa dello stato emittente del metallo avviene attraverso l'accoppiamento vibronico con oscillatori ad alta energia presenti nelle molecole di solvente [6,7].
La velocità del processo è legata a due fattori: è proporzionale al numero di oscillatori presenti nella prima sfera di coordinazione ed è inversamente proporzionale al parametro R:
¥)
con&Mac198;E l'intervallo di energia fra lo stato emittente e lo stato J ad energia più alta del multipletto fondamentale, hw il quanto vibrazionale dell'oscillatore, m è la sua massa ridotta e k la sua costante di forza.
In pratica R è il numero di quanti vibrazionali contenuti in&Mac198;E e tanto minore è tale numero tanto maggiore è la velocità del processo di accoppiamento vibronico; dunque dalla figura 2.4 si capisce perché l'Eu3+ sia più sensibile al fenomeno rispetto al Tb3+.
L'accoppiamento vibronico è particolarmente veloce con oscillatori ad alta energia come i gruppi OH, presenti in molti solventi comuni come ad esempio l'acqua e il metanolo. La sostituzione degli oscillatori OH con quelli OD, ottenibile con l'uso di solventi deuterati, fa diminuire l'efficienza del meccanismo di disattivazione non radiativa attraverso l'accoppiamento vibronico e ciò determina un aumento sia dei tempi di vita che delle intensità di emissione: tale effetto prende il nome di effetto isotopico. Infatti data la maggior inerzia degli oscillatori OD, i suoi quanti vibrazionali sono minori rispetto a quelli dell'oscillatore OH e ciò, in base alla ¥, determina valori più bassi della costante di accoppiamento nei solventi deuterati rispetto ai corrispettivi non deuterati (figura 2.4).
Figura 2.4: Rappresentazione dell'accoppiamento vibronico degli stati emittenti di Eu3+ Tb3+ con gli oscillatori OH e OD. Un quanto dell'oscillatore OH e di circa 4000 cm-1 mentre quello di un OD è di circa la metà.
l'effetto isotopico si può misurare con il parametro a:
¥¥) a = Id/Ih
dove Id è l'intensità di emissione ad una certa lunghezza d'onda nel solvente deuterato e Ih quella nel corrispondente non deuterato.
La figura 2.5 mostra l'effetto isotopico per gli ioni Ln3+ centrali: si può vedere come Eu3+ è più sensibile all'effetto isotopico che Tb3+.
Figura 2.5: La figura rappresenta come varia il parametro a per i Ln3+ centrali: è da notare come l'effetto isotopico per Eu3+ sia più alto di quello tutti gli altri Ln3+ e al contrario il più basso sia quello del Gd3+.
La costante di velocità per il processo di accoppiamento vibronico con gli oscillatori OH, Knr(OH), si ottiene dall'equazione ¥¥¥:
¥¥¥)
Horroks e Sudnick hanno provato sperimentalmente la proporzionalità fra Knr(OH) e il numero di molecole coordinate [8-9]. Essi hanno ricavato l'espressione ¥V che ci permette di stabilire con un errore di ±0.5 il numero di molecole di acqua presenti nella prima sfera di coordinazione:
¥V)
con q un parametro empirico che ha un valore di 1.05 per i complessi di Eu3+ e 4.2 per quelli di Tb3+.
Nell'ipotesi che l'effetto di una molecola di metanolo corrisponda alla metà dell'effetto di una molecola di acqua, Horrocks ha proposto una analoga espressione (V) per i complessi in metanolo [10]:
V)
con q del valore di 2.1 per i complessi di Eu3+ e 8.4 per quelli di Tb3+.
Con l'uso di anioni che competano con successo nella coordinazione dello ione con molecole come acqua e metanolo e che abbiano oscillatori con basse energie, si riesce ad aumentare le intensità di emissione dei complessi di Eu3+ e Tb3+ [11].
Illustriamo ora il processo due.
E' possibile che lo stato emittente del metallo o gli stati di singoletto e tripletto centrati sul legante possano popolare stati di trasferimento di carica dal legante al metallo (LMCT) e dal metallo al legante (MLCT).
E' noto che i complessi di Eu3+ presentano LMCT ad energie relativamente basse e questo perché lo ione Eu3+ è facilmente riducibile (E°(Eu3+ / Eu2+) = -0.38V). Naturalmente tali stati cadono ad energie diverse a seconda della natura dei leganti: ad esempio nello spettro di assorbimento del criptato [Eu [2.2.1.]]3+ ( figura 2.6) sono state evidenziate due bande LMCT centrate a 298 nm (e = 11 M-1 cm-1) e a 248 nm (e = 93 M-1 cm-1) [12,13].
Figura 2.6: Criptato [Eu [2.2.1.]]3+: è un biciclo con le due teste di ponte costituite da azoti.
Per i complessi di Tb3+ le bande LMCT sono da aspettarsi ad energia molto elevata poiché Tb3+ non è facilmente riducibile (E°(Tb3+ / Tb2+) = -3.7V).
D'altro canto i seguenti potenziali di riduzione (E°(Eu4+ / Eu3+) = 3.3V e E°(Tb4+ / Tb3+) = 6.4V ) mostrano che sia Eu3+ che Tb3+ sono difficilmente ossidabili: ci si deve dunque aspettare che gli stati MLCT si trovino ad alte energie per i complessi di entrambi questi ioni.
Si può quindi concludere che nei complessi di Eu3+ si possono avere disattivazioni nonradiative attraverso stati eccitati LMCT: questi stati possono essere popolati dallo stato emittente del metallo e/o da stati LC (figura 2.7) ed è stato dimostrato che gli stati eccitati LMCT dei complessi di Eu3+ subiscono efficienti disattivazioni nonradiative allo stato fondamentale. Per esempio i rendimenti quantici di emissione per eccitazione in stati LMCT del criptato [Eu [2.2.1.]]3+ [12,13] sono di un ordine di
Figura 2.7: Disattivazione dello stato emittente dello ione Eu3+ attraverso stati LMCT a bassa energia. E' da notare come lo spegnimento della luminescenza possa avvenire anche a causa del popolamento degli LMCT da parte degli stati eccitati del legante.
grandezza più bassi rispetto a quelli per eccitazione di stati centrati sul metallo: analogo fenomeno era stato messo in evidenza da Blasse nello studio di matrici contenenti Eu3+ [14].
Illustriamo ora il processo tre
Se la differenza energetica fra lo stato emittente del metallo e il più basso stato di tripletto è piccola, è possibile che lo stato emittente, una volta popolato, popoli attraverso un processo termicamente attivato lo stato di tripletto che si disattiva efficacemente allo stato fondamentale; questo processo è chiamato "back energy tranfer" (figura 2.8).
Data l'energia più elevata dello stato emittente del Tb3+ rispetto a quella di Eu3+ (figura 1.4) il "back energy tranfer" sarà più efficiente nei complessi di Tb3+ che in quelli di Eu3+.
Lo studio della fosforescenza del più basso stato eccitato di tripletto nei complessi di Gd3+, non essendo essa spenta dagli stati emittenti del metallo che si trovano ad energie molto più alte (2.9), permette una valutazione dell'energia dello stato di tripletto nei complessi di Eu3+ e Tb3+.
La costante relativa ai processi termicamente attivati si indica con knr(t) e si può ricavare da misure di tempi di vita fatti a temperatura ambiente e a 77K (V).
V)
Figura 2.8: Disattivazione dello stato emittente dello ione Tb3+ attraverso lo stato di tripletto, il quale a sua volta può emettere, disattivarsi non radiativamente o essere spento da un quencher.
Figura 2.9: Lo stato 6P7/2 del Gd3+ non può essere popolato dagli stati LC, trovandosi esso ad energie notevolmente più alte: dunque nei complessi di Gd3+ la fosforescenza del tripletto non è spenta e ammettendo con una buona approssimazione che l'effetto del Gd3+ sull'energia degli stati eccitati del legante sia uguale a quella di Eu3+ e Tb3+, la misura dell'energia del tripletto a più bassa energia, ricavabile dallo spettro di fosforescenza dei complessi di Gd3+, permette una valutazione dell'energia del tripletto nei complessi di Eu3+ e Tb3+.
2.4) Bibliografia
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CAPITOLO III: Applicazioni
3.1) Saggi immunologici
Com'è noto i linfociti, cellule preposte alla difesa contro gli antigeni, specie estranee all'organismo, producono e secernono gli anticorpi. L'anticorpo riconosce selettivamente l'antigene, si fissa su di esso per costituire il complesso anticorpo-antigene e l'antigene viene così neutralizzato [1].
L'elevata selettività dell'immunoreazione risiede nella complementarità fra i siti reattivi dell'anticorpo e dell'antigene, denominati epitopi, e la specificità delle immunoreazioni è sfruttata nel dosaggio quantitativo degli antigeni presenti nell'organismo [2,3]. Per rilevare l'immunocomplesso si fa uso di anticorpi marcati con traccianti radioattivi; questi sono i più usati e con essi si effettuano i saggi radioimmunologici. I saggi radioimmunologici sono superiori a qualsiasi altra tecnica in vitro grazie alla specificità dell'immunoreazione e alla elevata sensibilità del metodo che permette di determinare la concentrazione dell'immunocomplesso fino a 10-15-10-18 moli/l [4].
In questi ultimi anni, a causa di alcuni grossi svantaggi legati all'uso dei radioisotopi si è cercato di sviluppare dei traccianti non isotopici alcuni dei quali sono rappresentati in figura 3.1.
Con i traccianti enzimatici l'immunoreazione è seguita grazie all'azione catalitica dell'enzima che trasforma, ad esempio, una specie incolore in una colorata; con un numero elevato di cicli catalitici si può ottenere una elevata sensibilità. Gli svantaggi sono legati ad un segnale che dipende molto dalla temperatura e dal tempo di incubazione e dunque le analisi non sono sempre riproducibili; inoltre gli enzimi possono essere sensibili alla presenza di enzimi endogenici e inibitori; infine, dato il loro peso molecolare elevato, possono dare impedimenti sterici e modificare l'interazione antigene anticorpo [5].
Figura 3.1: Classi di traccianti non isotopici usati nei saggi immunologici.
I traccianti luminogenici si dividono in fotoluminescenti, bioluminescenti e chemioluminescenti. I primi emettono luce in seguito ad assorbimento di luce, i secondi in seguito ad una reazione enzimatica e i terzi in seguito a una reazione chimica.
I primi traccianti fotoluminescenti usati sono stati forti fluorofori quali la fluorescina. Il maggior problema legato all'uso di tali traccianti è dovuto all'emissione di fondo delle specie biologiche, il quale cade nell'UV ed è a vita breve (nell'ordine dei nanosecondi) come l'emissione del tracciante [6].
Il salto di qualità con i traccianti fotoluminescenti è stato ottenuto con l'uso di traccianti a lunga vita in zone spettrali a più bassa energia e fra essi i più importanti sono i composti di Eu3+ e Tb3+. Infatti questi sono dotati di luminescenza a lunga vita dell'ordine dei millisecondi nel visibile, come ampiamente mostrato nei capitoli precedenti; dati i lunghi tempi di vita si è in grado di effettuare misure risolte nel tempo nelle quali viene minimizzata l'interferenza dovuta all'emissione del fondo (figura 3.2) [7,8,9,10].
Figura 3.2: Principio dell'analisi fluoroimmunologiche risolte nel tempo (Time Resolved Fluoro Immuno Assay o TR-FIA): il ritardo temporale che intercorre dall'eccitazione alla misura permette di azzerare l'emissione del fondo a breve vita. Nelle apparecchiature usate per questo tipo di analisi la sorgente é pulsata con frequenze di circa 1000 Hz.
Le tecniche fluoroimmunologiche più diffuse sono quelle di tipo eterogeneo e fra esse la più famosa è il metodo D. E. L. F. I. A. (figura 3.3) [10,11]. Su un supporto polimerico si fissano gli anticorpi non marcati; si aggiunge successivamente la soluzione dell'antigene da dosare e, dopo il lavaggio, si aggiunge un anticorpo marcato. Successivamente si lava per eliminare le specie non legate e l'antigene che si vuol dosare risulta così catturato a "sandwich" fra i due anticorpi. Il tracciante del secondo anticorpo è costituito da un chelato di Eu3+ stabile nelle condizioni operative ma non emittente. Quindi il chelato viene dissociato a bassi Ph e viene aggiunto un bdichetone capace di formare un complesso fortemente luminescente con Eu3+. Il complesso è formato all'interno di una micella di ossido di triottilfosfina (T.O.P.O.). che protegge l'Eu3+ dalle molecole di acqua.
Figura 3.3: Principio dell'analisi DELFIA (vedi testo).
Allo scopo di eliminare stadi di separazione e lavaggio si sono sviluppati metodi omogenei. Un metodo sviluppato nel 1984 [12] si basa su un processo di spegnimento della luminescenza del tracciante alla formazione dell'immunocomplesso, grazie a un processo di trasferimento di energia ad un donor posizionato sull'antigene. Il processo è schematizzato nella figura 3.4.
Un metodo analogo sviluppato da Mathis nel 1993 [13] e che utilizza un criptato di Eu3+ con tris bipiridina diammina (TBP) studiato dal nostro gruppo di ricerca [14] è basato sulla modificazione della intensità di emissione del donor, Eu (TBP) e dell'acceptor, alloficocianina (ACP), posizionati su due anticorpi a diversa specificità; la modifica avviene quando i due anticorpi schiacciano a sandwich l'antigene (figura 3.5).La tabella 3.1 dà un confronto fra dosaggi omogenei ed eterogenei.
Figura 3.4: Principio dell'analisi omogenea sviluppata da Winfrey e Wagman nel 1984.
Figura 3.5: Principio dell'analisi omogenea sviluppata da Mathis.
Saggi omogenei Saggi eterogenei
Semplici da effettuare Procedure complicate
Facili da automatizzare Difficili da automatizzare
Sensibilità limitata Sensibilità elevata
Utilizzabili in un ristretto intervallo di concentrazioni Ampio intervallo di concentrazioni
Applicabili solo ad antigeni di piccole dimensioni Applicabili ad antigeni di ogni dimensione
Sensibili ad interferenze del campione
Tabella 3.1: Confronto fra saggi omogenei ed eterogenei.
Il maggior svantaggio dei saggi omogenei sono la sensibilità limitata a causa delle interferenze del fondo e lo scopo del nostro lavoro è lo sviluppo di traccianti fotoluminescenti costituiti da complessi di Eu3+ e Tb3+ che manifenstino:
1) Solubilità in acqua
2) Stabilità in ambiente proteico e salino
3) Assorbimento molto efficace sopra i 300 nm
4) Possedere un elevato rendimento quantico di emissione
5) Possedere alti tempi di vita degli stati emittenti
3.2) Bibliografia
[1] T. M. Devlin, "Manuale di Biochimica con Aspetti Clinici", Liviana Università, 1990, p.101.
[2] L. Stryer, "Biochemistry", Freeman, New York, 1988.
[3] R. Zuk, G. Rowley, E Ulmann, Clin. Chem., 25 (1979), 1554.
[4] L.E.M. Miles, C.N. Hales, Nature, 219 (1968), 186.
[5] K.E. Rubenstein, R. S. Schneider, E. F. Ulmann, Biochem. Biophys. Res. Commun., 47 (1972), 846.
[6] E. P. Diamandis, Clin. Biochem., 21 (1988), 239.
[7] A. Mayer, S.Neuenhofer, Angew. Chem. Int. Ed Engl., 33 (1994), 1044.
[8] T. Staltberg, E. Makela, H. Mikola, P. Mottram, I.A.Hemillä, Int. Lab., 101 (1994), 14.
[9] E. Soini, I.A.Hemillä, Clin. Chem., 25 (1979), 353.
[10] I.A.Hemillä, S. Dakubu, V. M. Mukkala, P. Mottram, A. Siitari, T. Lovgren, An. Biochem., 137 (1984), 335.
[11] I.A.Hemillä, S. Dakubu, US Patent 4565 790 (1986).
[12] L. Winfrey, B. Wagman, Int.Clin. Product Rewiews, (sett./ ottob.1984), 10.
[13] G. Mathis, Clin. Chem., 39 (1993), 1953.
[14] B. Alpha, R. Ballardini, V. Balzani, J.M. Lehn, S. Perathoner, N. Sabbatini, Photochem. Photobiol., 52 (1990), 299.
CAPITOLO IV: Parte sperimentale
4.1) Misure spettrofotometriche di assorbimento e luminescenza
Gli spettri di assorbimento sono stati fatti con uno spettrofotometro Perkin-Elmer Lambda 6 con una risoluzione ±1nm.
Gli spettri di emissione e di eccitazione sono stati ottenuti con uno spettrofluorimetro Perkin-Elmer LS50 con una risoluzione di ±2.5nm e con uno spettrofluorimetro Perkin-Elmer 650-40 con una risoluzione di ±1nm.
A temperatura ambiente gli spettri sono stati misurati in celle spettrofluorimetriche di quarzo da 3.5 ml, mentre quelli a 77K in capillari di quarzo immersi in un dewar con azoto liquido.
4.2) Tempi di vita di luminescenza
I tempi di vita degli stati emittenti sono stati misurati con uno spettrofluorimetro Perkin-Elmer LS50 a sorgente pulsata mediante la successiva elaborazione delle curve di decadimento dello stato emittente con un programma di minimi quadrati. I tempi di vita a 300K sono stati misurati in celle spettrofluorimetriche di quarzo e quello a 77K in capillari di quarzo immersi in un dewar contenente azoto liquido.
L'errore associato a questo tipo di misure é del 10%.
4.3) Rese quantiche di emissione
Le rese quantiche di emissione dei complessi di Eu3+ e Tb3+ sono state determinate usando il metodo descritto da Haas e Stein [1], correggendo per il diverso indice di rifrazione per le misure in solventi non acquosi [2].
Lo standard usato per i complessi di Eu3+ è rutenio trisbipiridile con una resa quantica di emissione di 0.0028 in soluzione acquosa areata [3]; per quelli di Tb3+ si è usato solfato di chinina con una resa quantica di 0.546 in soluzione acquosa di acido solforico 1N [4].
L'errore associato a questo tipo di misure è del 30%.
4.4) Solventi
I solventi usati per le misure fotofisiche sono acetonitrile Merck uvasol al 98.8% da 500 ml, acetonitrile anidro della Romil al 99.9% da 50 ml , metanolo della Merck uvasol al 99.9%, da 500 ml, metanolo tetradeuterato della Merck da 10 ml al e al 99.99% di purezza isotopica, metanolo monodeuterato della Aldrich da 25 ml al 99.8% e al 99.99% di purezza isotopica e monodeuterato della Carlo Erba da 25 ml al 99.8% e al 99.99% di purezza isotopica.
4.5) Complessi studiati
I leganti macrociclici funzionalizzati (figura 6.1) e i loro complessi sono stati sintetizzati dal gruppo di ricerca del Dr. R. Ziessel dell'Ecole Européenne des Hautes Etudes des Industries Chimiques, Strasburgo, Francia.
I calixareni funzionalizzati (figura 7.1) sono stati sintetizzati dal gruppo del Prof. R. Ungaro dell'Università di Parma. I complessi di questi leganti con gli ioni Eu3+ e Tb3+ sono stati preparati in questo lavoro di tesi.
4.6) Bibliografia
[1] Y. Hass, G. Stain, J. Chem. Phys., 75 (1971), 3668.
[2] J. N. Demas, G. A. Crosby, J. Phys. Chem., 75 (1971), 991.
[3] K. Nakamaru, Bull. Chem. Soc. Jpn., 55 (1982) 3697.
[4] S. R. Meech, D. Phillips, J. Phochem., 23 (1983) 193.
