Cause

Fattori genetici ed ambientali nell’eziologia della labiopalatoschisi non sindromica

Rubini M., Calzolari E.

La labiopalatoschisi (LPS) è una malformazione craniofacciali particolarmente frequente, presentandosi con una incidenza alla nascita di circa 1:1000.

Si ritiene sia determinata dalla mancata fusione delle prominenze frontonasali e mascellari durante la settima settimana gestazionale, a cui può conseguire, come evento secondario nella settimana successiva, la mancata fusione dei piani palatini.

Lo sviluppo della regione orale si realizza attraverso l’interazione coordinata di un ampio numero di processi biologici che comprendono proliferazione, migrazione e differenziamento cellulare, adesione intercellulare, apoptosi e che sono regolati da segnali autocrini, paracrini ed endocrini.

Mutazioni in geni codificanti per componenti funzionali di questi processi o fattori ambientali teratogenici possono determinare alterazioni nel complesso schema di sviluppo orofacciale e causare malformazioni craniofacciali come la labiopalatoschisi.

In circa il 14% dei casi la LPS si manifesta accompagnata da altre anomalie malformative, mentre nell’11% dei casi viene inquadrata all’interno di sindromi monogeniche. Le forme isolate presentano una forte predisposizione genetica, evidenziata dall’elevato tasso di concordanza tra gemelli monozigoti (36%) rispetto ai di zigoti (4.7%) e dall’elevato rischio di ricorrenza (circa 4%) in famiglie con un affetto, che sale al 9% se sono presenti due affetti (Mitchel e Risch, 1992).

Il rischio relativo per fratelli (ls) della LPS è di circa 30, un valore comparabile a quello di altre patologie genetiche complesse come il diabete di tipo I, la sclerosi multipla e l’autismo.

I fattori genetici alla base della suscettibilità allo sviluppo di questa malformazione sono prevalentemente sconosciuti. Numerose evidenze concorrono ad indicare che anche fattori di natura ambientale che influenzano o interferiscono con lo sviluppo embrionale del labbro e del palato, quali l’uso di farmaci anti-epilettici, il fumo e carenze nel metabolismo dei folati nella madre, costituiscono importanti componenti dell’eziologia della LPS. Questi fattori esercitano il loro effetto teratogeno in congiunzione con particolari assetti genotipico riguardanti geni del metabolismo di micronutrienti e del catabolismo di farmaci e xenobiotici. Lo studio di questi geni si aggiunge a quello di altri candidati eziologici identificati sulla base del loro ruolo nello sviluppo embrionale delle strutture orofacciali.

La LPS non sindromica viene inquadrata come patologia complessa ad eziologia multifattoriale, alla quale concorrono fattori genetici di suscettibilità e fattori di rischio ambientali. L’identificazione delle componenti di predisposizione allo sviluppo della LPS isolata è l’oggetto di linee di ricerca che comprendono studi di associazione tra patologia e alleli a geni candidati, analisi di linkage in famiglie con ricorrenza di LPS, studi sui casi associati ad alterazioni citogenetiche e sulle sindromi mendeliane, studi su modelli animali, analisi epidemiologica di fattori di rischio ambientale e studi di interazione gene-ambiente.

Studi di Associazione

L’approccio più ampiamente applicato nella identificazione di fattori di rischio genetico per LPS è costituito dalla ricerca di varianti alleliche che si manifestano in associazione al fenotipo malformativo. Lo studio di associazione parte dalla selezione di geni candidati individuati sulla base delle loro proprietà funzionali, sulla loro tessuto-specificità di espressione, sulla loro localizzazione cromosomica o sulla omologia a geni per LPS murina. L’analisi epidemiologica delle varianti geniche a questi candidati nella popolazione può condurre alla identificazione di alleli che si manifestano con incrementata frequenza in soggetti affetti, e suggerire un possibile ruolo eziologico di mutazioni nel gene in esame. Questo approccio necessita che la popolazione studiata non presenti stratificazione e richiede che la variante genica analizzata coincida o sia in linkage disequilibrium con la mutazione patogenetica.

Il gene TGFA codificate per il Transforming growth factor a è stato il primo a risultare associato a LPS (Ardinger et al., 1989). Studi con test di disequilibrio di trasmissione (TDT) e di interazione gene-ambiente attribuiscono a TGFA una funzione di gene modificatore (Shaw et al., 1996; Maestri et al., 1997), mentre risultati prevalentemente negativi di analisi di linkage non ne attribuiscono un ruolo di gene dominante (Hecht et al., 1993). Malgrado l’evidenza di associazione tra TGFA e LPS, i risultati di ricerche sperimentali in modelli murini non sostengono un ruolo nello sviluppo di questa malformazione (Machida et al., 1999). Sulla base di analisi istologiche TGFA risulta particolarmente espresso in corrispondenza dell’epitelio del palato durante la fase di fusione dei piani palatini (Dixon et al., 1991; Iameroon et al., 1996). Questo fattore di crescita è riconosciuto come ligando dal recettore per EGF (EGFR), che svolge una funzione essenziale nello sviluppo craniofacciale (Miettinen et al., 1999).

Il gene TGFB3, codificate per il Transforming growth factor b3 (TGFb3), risulta associato a LPS (Maestri et al., 1997; Lidral et al., 1998). Topi knockout per TGFB3 manifestano PS (Proetzel et al., 1995), ed il fattore di crescita TGFb3 risulta essenziale per il processo di fusione dei piani palatini durante l’embriogenesi (Dixon e Ferguson, 1992; Brunet et al., 1995). In un caso di PS associato a traslocazione cromosomica, un sito di rottura risulta cadere in prossimità del gene TGFB3. Il gene pertanto è ritenuto un forte candidato per la PS isolata.

Altre evidenze di associazione sono riportate per l’omeogene MSX1 (Lidral et al., 1997 e 1998), per il gene del recettore dell’acido retinico (RARA) (Chenevix-Trench et al., 1992; Shaw et al., 1993), per il gene BCL3 (Stein et al., 1995; Wyszynski et al., 1996; Maestri et al., 1997) e per il gene codificante l’enzima Metilene-Tetraidrofolato Reduttasi (MTHFR) (Tolarova et al., 1998; Martinelli et al., 2001).

Analisi di Linkage

L’analisi di segregazione ha reso evidente come la LPS non sindromica sia una condizione non-mendeliana riconducibile ad una eziologia multifattoriale. In alcuni casi sono state descritte famiglie con trasmissione apparentemente dominante del fenotipo LPS, nelle quali è stato dimostrato linkage per loci maggiori dominanti con penetranza incompleta quali F13A (Eiberg et al., 1987), BCL3 (Stein et al., 1995), 6p23 (Carinci et al., 1995), e TGFA (Pezzetti et al., 1998). Dati meno convincenti riportano anche casi di famiglie con segregazione autosomica recessiva di LPS (Marazita et al., 1992; Ballew et al., 1993). Al fine di superare i limiti oggettivi dell’analisi parametrica di linkage, principalmente determinati dall’esiguità di estese famiglie con ricorrenza di LPS, è stata avviata una indagine secondo un approccio non-parametrico che si basa sull’analisi di coppie di fratelli affetti. Dato il relativamente alto rischio di ricorrenza che caratterizza la LPS, la raccolta di casi di ricorrenza in fratrie risulta molto più praticabile che quella di ampie famiglie multiplex. I casi sono stati studiati mediante analisi di polimorfismi multiallelici distribuiti nel genoma e distanziati tra loro di circa 5 cM (Prescott et al., 2000). L’analisi ha fornito indicazione dell’esistenza di una decina di loci per LPS, confermando l’inquadramento nel contesto di un modello multifattoriale, e dimostrando la mancanza di un singolo gene maggiore per LPS. Tra i diversi loci di suscettibilità identificati alcuni risultano coincidere con le localizzazioni cromosomiche di candidati per schisi orofacciali quali TGFA (2p13), OFC1 (6p23-24), MTHFR (1p36) e TBX22 (Xq21).

L’analisi di linkage fornisce indicazioni sull’esistenza di geni di suscettibilità per LPS all’interno di regioni genomiche relativamente ampie. L’informazione posizionale consente di individuare all’interno della regione associata geni candidati su base funzionale. Questi possono convenientemente essere testati mediante applicazione del Transmission Disequilibrium Test (TDT), un metodo basato sull’analisi di nuclei familiari che supera i limiti del classico test caso-controllo, imposti dalla possibile stratificazione della popolazione. La raccolta di triadi composte da soggetto affetto e dai due genitori, applicando una ampia collaborazione multicentrica, è oggetto del progetto EUROCRAN, recentemente avviato in nove Paesi Europei, tra cui l’Italia.

L’applicazione del TDT ha rivelato associazione con i geni BCL3 (Stein et al., 1995) e TGFB3 (Maestri et al., 1997).

Data la natura multifattoriale della LPS, è necessario che i risultati di associazione ottenuti mediante TDT vengano interpretati alla luce della specificità etniche ed ambientali che caratterizzano i vari gruppi di pazienti. Deve essere tenuto presente che il contributo di suscettibilità che può fornire una variante genica in un particolare contesto genetico-ambientale non necessariamente si manifesta in contesti diversi, e che quindi la ripetibilità dei risultati è vincolata all’omogeneità dei confronti.

Alterazioni cromosomiche associate a schisi facciali

Anomalie cromosomiche si manifestano nel 6% delle anomalie di sviluppo, ed il loro studio consente di fornire indicazioni sulla localizzazione genomica di importanti geni coinvolti nella embriogenesi e nello sviluppo somatico. Traslocazioni cromosomiche sono state caratterizzate in soggetti con schisi orofacciali, prevalentemente a carico del palato secondario. La regione 6p23-24 è stata la prima a risultare associata a LPS. Davies et al. (1995) descrissero due casi di LPS bilaterale con traslocazioni bilanciate caratterizzate da un breakpoint in 6p23 ed un caso di LPS nel contesto di un quadro malformativo multiplo presentante una delezione del segmento distale a 6p23 del braccio corto del cromosoma 6. In alcune famiglie con ricorrenza di LPS questa regione è risultata segregare in linkage con la malformazione, sebbene con bassa penetranza (Carinci et al., 1995; Scapoli et al., 1996, 1997).

Secondo quanto riportato dallo Human Cytogenetics Database (HCDB) il 5% dei casi di malformazioni congenite associate a delezioni autosomiche presenta LPS (Schnitzel et al., 1994). La LPS è presente inoltre nel 5% dei casi malformativi caratterizzati da duplicazioni cromosomiche.

I dati dello HCDB indicano la presenza di almeno quattro regioni associate a LPS in condizioni di aploinsufficienza: 1q21-25, 4p15-16, 4q31-35 e 7q34-35 (Brewer et al., 1998). Tra questi, la regione 4p15-16 risulta particolarmente interessante in quanto comprende l’omeogene MSX1. L’analisi dei dati dello HCDB rivela una mappa di duplicazione associata a LPS che comprende quattro loci: 3q21-26, 10p15-11, 11p14-11 e 13q22-24 (Brewer et al., 1999). Tra questi è compresa la regione 11p14-11 nella quale sono localizzati i geni per i recettori dei folati, riconosciuti come candidati funzionali per le schisi orofacciali.

Interazione gene-ambiente

Si ritiene che l’elevata incidenza di schisi orofacciali in popolazioni con basso stato socioeconomico sia in parte riconducibile a carenze nutrizionali, ed in particolare al ridotto apporto vitaminico durante la gestazione. Studi prospettivi indicano che la somministrazione di elevate dosi di acido folico durante la gravidanza riduce il rischio di ricorrenza di LPS (Tolarova, 1982; Shaw et al., 1995; Tolarova e Harris, 1995), mentre studi retrospettivi hanno dimostrato che l’integrazione dietetica con formulazioni multivitaminiche conferisce protezione verso l’occorrenza di LPS, (Shaw et al., 1995; Hayes et al., 1996; Czeizel et al., 1996; Werler et al., 1999; Loffredo et al., 2001; Itikala et al., 2001). L’effetto protettivo dell’acido folico si manifesta con livelli diversi a seconda dei gruppi etnici, probabilmente in dipendenza dei particolari assetti genotipico che contraddistinguono le popolazioni. In particolare sono oggetto di indagine geni che controllano il metabolismo dei folati, quali MTHFR e FOLR, che sono localizzati in aree genomiche in linkage con LPS (Prescott et al., 2000).

La mutazione 677C>T nel gene MTHFR conferisce termolabilità e ridotta attività nell’enzima codificato. In condizioni di insufficiente apporto alimentare di folati gli omozigoti TT manifestano una riduzione dei livelli di folati plasmatici, aumento dei folati eritrocitari ed una moderata iperomocisteinemia (Frosst et al., 1995; Van der Put et al., 1995). Uno studio condotto in argentina ha dimostrato l’esistenza di una associazione tra genotipo omozigote TT e sviluppo di LPS non-sindromica (Tolarova et al., 1998). Questa evidenza ha trovato solo incompleta conferma in altri studi (Shaw et al., 1998; Gaspar et al., 1999; Mills et al., 1999). La suscettibilità allo sviluppo di LPS in soggetti omozigoti TT si manifesta in dipendenza ad apporti nutrizionali relativamente bassi di folati nelle madri durante il primi mesi di gravidanza.

Indagini condotte in Olanda hanno evidenziato come madri di soggetti affetti da LPS presentino livelli significativamente aumentati di folati eritrocitari e dell’omocisteina serica (Wong et al., 1999), e uno studio italiano su casistica proveniente da famiglie con ricorrenza di LPS indica un significativo incremento dell’omozigosi TT in madri di soggetti affetti (Martinelli et al., 2001). Queste evidenze, seppur preliminari, suggeriscono un ruolo importante della relazione materno-fetale nell’eziologia della LPS.

L’importanza dell’interazione tra ambiente uterino e genotipo fetale è stata indagata in relazione a fattori teratogeno quali il fumo di sigaretta e l’abuso di alcol.

Il fumo si associa ad un raddoppio del rischio di sviluppare LPS nel nascituro. I risultati di uno studio caso-controllo svoltosi in California mostrano come il rischio relativo salga ad un valore 6 in dipendenza di particolari genotipi TGFA nell’affetto (Shaw et al., 1996). Questa evidenza non ha trovato riscontro in altri studi (Beaty et al., 1997; Christensen et al., 1999; Romitti et al., 1999). Nell’indagine condotta da Romitti et al (1999) è stato tuttavia riscontrato che l’interazione tra il consumo di alcol in gravidanza e in particolare genotipo MSX1 nel nascituro si associ ad incrementato rischio di LPS.

Prospettive della ricerca

Le ricerche prodotte nell’ultimo decennio per lo studio delle cause genetiche ed ambientali della LPS hanno consentito l’individuazione di un ampio spettro di geni associati allo sviluppo della malformazione e di specifici fattori di rischio ambientale, pur non avendo ancora condotto a risultati conclusivi. Sicuramente è chiaro che la LPS isolata non è riconducibile ad un locus maggiore di suscettibilità, ma costituisce una condizione multifattoriale alla quale, oltre a precise condizioni ambientali, contribuiscono in modo complesso varianti geniche che interessano geni dello sviluppo embrionale delle strutture orofacciali e geni del metabolismo dei micronutrienti e degli xenobiotici. La frequente mancanza di riproducibilità dei risultati tra studi epidemiologici condotti in popolazioni diverse è verosimilmente riconducibile alle differenti frequenze genotipiche che caratterizzano i diversi gruppi etnici. E’ riconosciuto che il fenotipo LPS sia determinato dall’effetto cumulativo di diversi loci, ma probabilmente sono numerose le combinazioni genotipiche che portano allo sviluppo della malformazione ed il loro effetto è prevedibile si manifesti solo in dipendenza di condizioni ambientali particolari e specifiche per i diversi geni contribuenti.

Alla luce di questo modello si comprende il parziale insuccesso degli studi basati sul classico approccio mediante analisi parametrica di linkage. Gli sviluppi della ricerca devono convenientemente basarsi su indagini multilocus di associazione, condotte preferibilmente su casistiche appartenenti a gruppi etnicamente omogenei e analizzate in relazione ai diversi livelli di esposizione a specifici fattori di rischio ambientale.

Bibliografia

Ardinger et al., Am J Hum Genet 45, 348-353, 1989

Ballew et al., Cleft Palate-Cranio J 30, 411-413, 1993

Beaty et al., , Cleft Palate-Cranio J 34, 447-454, 1997

Braybrook et al., Nature Genetics, 2001

Brewer et al., Am J Hum Genet 63, 1153-1159, 1998

Brewer et al., Am J Hum Genet 64, 1702-1708, 1999

Brunet et al., Int J Dev Biol 39, 3455-355, 1995

Carinci et al., Am J Hum Genet 56, 337-339, 1995

Chenevix-Trench et al., Am J Hum Genet 51, 1377-1385, 1992

Christensen et al., Am J Med Genet 84, 151-157, 1999.

Czeizel et al., Teratology 553, 345-351, 1996.

Davies et al. Hum Mol Genet 4, 121-128, 1995

Dixon e Ferguson, Arch Oral Biol 37, 395-410, 1992

Dixon et al., Anat Emb 184, 83-91, 1991

Eiberg et al., Clin Genet 32, 129-132, 1987

Frosst et al., Nat Genet 10, 111-113, 1995.

Gaspar et al., Am J Med Genet 87, 197-199, 1999

Hayes et al., Am J Epidemiol 142:,1229-1234, 1996.

Hecht et al., Am J Hum Genet 52, 1230-1233, 1993

Iameroon et al., J Dent Res 75, 1534-1539, 1996

Itikala et al., Teratology 63, 79-86, 2001.

Jacobson e Trasler, Teratology 45, 393-400, 1992

Lidral et al., Cleft Palate-Cranio J 34, 1-6, 1997

Lidral et al., Am J Hum Genet 63, 557-568, 1998

Loffedo et al., Cleft Palate-Cranio J 38, 76-83, 2001.

Machida et al., Genomics 3, 237-243, 1999

Maestri et al., Am J Med Genet 73, 337-344, 1997

Marazita et al., Am J Hum Genet 51, 648-653, 1992

Martinelli et al., Am J Med Genet 98, 357-360, 2001.

Miettinen et al., Nat Genet 22, 69-73, 1999

Mills et al., Am J Med Genet. 86, 71-74, 1999.

Mitchel & Risch, Am J Hum Genet 51, 323-332, 1992

Mossey et al., J Med Genet 35, 371-378, 1998

Pezzetti et al., Genomics 50, 299-305, 1998

Proetzel et al., Nat Genet 11, 409-414, 1995

Prescott et al., Hum Genet 106, 345-350, 2000

Romitti et al., Teratology 59, 39-50, 1999

Scapoli et al., Minerva Biotech 8, 135-141, 1996

Scapoli et al., Genomics 43, 216-220, 1997

Schnitzel et al., Human Cytogenetics Database. Oxford Univ Press, 1994

Shaw et al., Am J Hum Genet 53, 1156-1157, 1993

Shaw et al., Lancet 346, 393-396, 1995.

Shaw et al., Am J Hum Genet 58, 551-561, 1996

Sozen et al., Nature Genet 2001

Stein et al., Am J Hum Genet 57, 257-272, 1995

Tolarova et al., Teratology 51, 71-78, 1995.

Tolarova et al., Am J Hum Genet 63, A27, 1998

Tolarova, Lancet 2, 217, 1982

Van der Put et al., Lancet 346, 1070-1071, 1995

Werler et al., Am J Epidemiol. 150, 675-682, 1999.

Wong et al., Teratology. 60, 253-257, 1999.

Wyszynski et al., Hum Genet 99, 22-26, 1996

HOME